Hortic Res 直播預告 | 用于逐步優化實時 RT-PCR 分析的優化方案

聯系人:卞越聯系方式:13851789902發布時間:2021-09-14



主講人

     劉武生,北卡州立大學園藝系助理教授。本科、碩士畢業于東北林業大學,博士畢業于田納西大學, 并在田納西大學完成了博士后和助理研究教授的訓練和研究工作,出國前曾在北京林業大學從事過四年的教學工作。


    長期從事植物技術、植物合成生物學和基因編輯的研究工作,發表論文28篇,其中1篇被F1000推薦。目前實驗室的主要研究方向包括: (1) 不依賴于基因型的、非轉基因的、往園藝植物遞送CRISPR/Cas9 的新方法研發, (2) 重要農藝性狀(比如種子大小和果實番茄紅素含量等)的分子機制研究, (3) 用基因工程和基因編輯提高園藝植物性狀。所研究的植物主要包括西紅柿、亞麻薺(camelina)、沙生蔗茅(Tripidium ravennae)、玫瑰、甘薯、土豆、生菜等,以最大限度確保我們的研究成果能轉化到更多的、具有相似性狀的園藝植物上。每年春季講授研究生課程“植物育種的分子生物學”。個人網頁:https://cals.ncsu.edu/horticultural-science/people/wliu25/


時間

2021年9月15日 上午9:00-10:30


形式

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本次分享會主要內容

分享會分為兩部分:

                    主講人講解主要內容+回答問題

主要內容:
用于逐步優化實時PT-PCR分析的優化方案


    實時逆轉錄PCR(qPCR)方法的準確性在很大程度上取決于引物的特異性、擴增條件的優化、和內參基因的穩定性。qPCR引物在線輔助設計的工具在很大程度上忽略了植物基因組中同源基因序列之間的相似性,可導致研究者因高估了所設計引物的質量而跳過qPCR的優化步驟。然而,qPCR參數的優化對每個基因引物的效率、特異性和靈敏性都起著至關重要的作用。不良的qPCR反應,可能會導致對實驗結果的錯誤解釋或實驗結果不可重復。

    該分享會將介紹一個易于操作的、系統的、全面優化的qPCR分析方案,該優化方案通過全基因組同源基因序列比對中的SNPs來設計基因特異性引物,逐步優化引物退火溫度、引物濃度和最佳模板cDNA質量(μg)范圍, 并將效率校準方法和標準曲線方法與2?ΔΔCt方法相結合以得到每個基因的每對引物的cDNA質量(μg)對數和相應的Ct值之間的標準曲線, 目標是得到優化后的qPCR擴增條件以滿足每個基因的最優引物對(primer pair)的R2≥0.99和效率 (E) = 100 ± 5% 。此時,就可以利用2?ΔΔCt方法對基因進行相對定量表達數據的分析。作為案例研究,將介紹該優化方案在觀賞和能源植物沙生蔗茅(Tripidium ravennae) 和大豆在不同生物或非生物脅迫實驗條件下的最優內參基因的鑒定上的應用。

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